Perkembangan Teknik Hibridoma

Perkembangan Teknik Hibridoma

Agus Sjahrurachman

Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta

PENDAHULUAN

Dalam kurun waktu puluhan tahun sejak Metchnikoff dan Erhlich mengemukakan teori imunologi sehingga mendapatkan hadiah Nobel 1908, banyak kemajuan yang telah dicapai baik pada imunologi seluler maupun humoral Sampai tahun 1975 walaupun imunologi khususnya imunokimia telah cukup maju, antibodi yang digunakan untuk mengikat atau mengenali suatu antigen masih dibuat dengan cara yang konvensional yaitu mengimunisasi hewan percobaan, mengambil darahnya dan mengisolasi antibodi dan serum sehingga menghasilkan antibodi polikional. Dalani antibodi poliktonal jumlah antibodi yang spesifik sangat sedikit, sangat heterogen karena dapat mengikat bermacam-macam epitop dan antigen yang diimunisasikan. Juga pembuatannya, dan awal pemurnian antigen sampai menghilangkan antibodi yang tidak diinginkan sangat memakan waktu dan sulit

Kohier dan Milstein (1975) memperkenalkan cara baru membuat antibodi dengan mengimunisasi hewan percobaan, kemudian sel limfositnya dihibridisasikan dengan biakan sel tertentu sehingga hibrid dapat dibiakkan terus menerus (immortal) dan membuat antibodi monoclonal. Antibodi monokional yang dibuat oleh sd hibrid mempunyai sifat tebih baik dan antibodi polikionat karena hanya mengikat 1 epitop serta dapat dibuat dalam jumlah tak terbatas. Terobosan teknik hibnidoma yang menghasilkan antibodi monoktonal terhadap antigen, membuka era baru cara identifikasi dan niemurnikan suatu motekul pada berbagai disiptin ilmu, juga membuka cakrawata dalam

prosedur diagnostik dan pengobatan dan pencegahan atternatif pada keganasan dan berbagai penyakit lain

.

PRINSIP PEMBUATAN ANTIBODI MONOKLONAL

Tujuannya ialah menciptakan sel pembuat antibody homogen yang dapat dibiakkan terus menerus (immortal), melalui :

1) Fusi sel limpa kebal dan sel mieloma

Pada kondisi biakanjaringan biasa, sel limpa yang membuat antibodi akan cepat mati sedangkan sel mieloma dapat dibiakkan terus menerus. Fusi sel dapat menciptakan sel

hibnd yang membuat antibodi seperti sel timpa dan dapat dibiakkan terus menerus seperti sel mieloma

2) Eliminasi sel induk yang tidak fusi

Frekuensi terjadinya hibrid sel timpa-sel mieloma biasanya rendah, karena itu penting untuk mematikan sel yang tidak fusi yang jumlahnya lebih banyak agar sel hibrid mempunyai kesempatan untuk tumbuh, dengan cara menggunakan:

Sel mieloma mutan yang mempunyai kelainan (defect) sintesis nukleotida yaitu sel mieloma yang tidak mempunyai enzim timidin kinase (TK) atau hypoxanthine phosphoribosyt transferase (HGPRT) sehingga dalam sintesis nukleotida tidak dapat menggunakan salvage pathway dan Media selektif yang dikembangkan oleh Littlefield, mengandung hypoxanthine, aminopterin dan thymidine (HAT). Aminopteninmenghambatjalan biasa biosintesis purin dan pirimidin sehingga memaksa sel menggunakan salvage pathway. Sel yang tidak fusi karena tidak mempunyai enzim timidin kinase atau hypoxanthine phosphonibosyttransferase akan mati, sedangkan sel hibrid karena mendapatkan enzim tersebut dan sel mamalia yang difusikan dapat menggunakan salvage pathway sehingga tetap hidup dan berkembang.

3) Isotasi Mon yang diinginkan

Sel hibrid dikembang biakkan sedemikian sehingga tiap sel hibrid akan membentuk kotoni sendiri. Tiap koloni kemudian dipelihara terpisah satu sama lain. Hibridoma yang terbentuk dipilih dengan cara mendeteks antibodi yang disekresikan dalam

Yang menjadi pertimbangan dalam memilih sel mieloma, adalah:

a) Spesies

Sel mieloma yang berasal dari spesies yang sama dengan binatang yang diimunisasi akan mengurangi segregasi kromosom pasca fusi. Contoh yang ekstrim ialah hibridoma sel mieloma mencit dengan sel limpa manusia,kromosom sel manusia dengan cepat mengalami segregasi sehingga hasil hibrid menjadi tidak stabil.Dalam perkembangannya, pemilihan sel mieloma yang berbeda spesies dapat dilakukan terutama untuk tujuan tertentu. Hibrid sel mencit dengan tikus telah dibuat dan berhasil baik, tetapi perbedaan spesies yang terlalu jauh dikatakan tidak produktif. Walaupun pembuatan antibodi monokional mencitdan tikus sudah berhasil baik, gunanya secara klinis sangat terbatas karena tetap merupakan protein asing untuk manusia. Karena itu dikembangkan hibrid manusia dengan mengembangkan sel mieloma manusia yang sensitif terhadap hypoxanthinc-aminopterinthymidine. Tim dari Stanford University telah berhasil membuat galur sel mieloma tersebut yaitu U-266 AR1 dengan nomor registrasi SKO-007. Sayangnya galur ini masih membuat sendiri Ig.

b) Sintesis imunoglobulin

Sel hibridoma mengekspresikan rantai imunoglobulin secara codominant, sehingga imunoglobulin dan sel mieloma akan diekspresikan bersama imunoglobulin dan sel limpa dengan kombinasi secara acak. Sebagai contoh, bila sel mieloma membentuk rantai berat dan rantai ringan imunoglobulin, seperti juga halnya dengan sel limpa, maka imunoglobulin dan sel hibrid merupakan kombinasi acak dari ke-4 rantai dan antibodi spesifik hanya terdapat 1/16 dari seluruh imunoglobutin yang terbentuk.. Karena itu pengembangan diarahkan untuk membuat sel mieloma yang tidak membuat rantai imunoglobulin tetapi tetap dapat fusi dengan baik. Gatur sel mieloma mencit SP2/O-Ag14 yang merupakan hasil reclone SP2/HI-Ag adalah sel mieloma pertama yang tidak membentuk rantai imunogtobutin

4) Medium biakan

Medium biakan umumnya DMEM atau RPMI 1640 dengan tambahan fetal calfserum (FCS) dan aditif lainnya. Yang menjadi masalah adalah FCS harganya mahal, sutit didapat dan kuali- tasnya sangat bervariasi tergantung sumbernya bahkan juga bervariasi untuk tiap batch. Penambahan FCS sangat penting, bahkan pada waktu fusi, seleksi dan cloning kadar FCS dalammedium sering dinaikkan. Dipilih FCS karena kandungan

imunogtobulinnya rendah sehingga tidak mempengaruhi assay serta sangat mendukung tumbuh dan kembang biak sel. Usaha pengembangan dilakukan untuk mendapatkan me-

dium tanpa serum karena memberi keuntungan memungkinkan penetitian yang tak memperbolehkan adanya protein serum atau bahan-bahan dan serum misalnya hormon,

antibodi. ekonomis, terutama untuk menumbuhkan sel dalam skala besar. mempermudah pemurnian antibodi monokional, bahkan pada beberapa keadaan, antibodi monokional dapat langsung digunakan tanpa pemurnian

. Salah satu dari medium tanpa serum adalah Serum-free KSLM medium yang menggunakan medium dasar RPMI 1640 + DMEM + Hams F-12 medium dengan perbandingan 2: 1: 1, ditambah insulin, 2-amino etanol, 2-merkaptoetanot, natrium selenit, LDL manusia, asam oleat dalam kompleks dengan albumin serum sapi (BSA)

. Serum- free KSLM medium terbukti sama baiknya untuk menumbuhkan sel mieloma NS- 1 dan sel hibnidoma (Tabet 2), dibandingkan medium dengan 10% FCS. Harus menjadi perhatian bahwa tidak semuajenis sel mieloma atau hibridoma cocok dengan medium tanpa serum

Keterangan :

N 1-503 = varian dan sel NS-1 yang telah diadaptasikan pada medium tanpa

lipid.

5) Fusi sel

Fusi sel diawali dengan fusi membran plasma sehingga menghasitkan sel besar dengan dua atau lebih inti yang berasal dari kedua induk sel yang berbedajenis, disebut heterokaryon, pada waktu tumbuh dan membelah diri terbentuk 1 inti yang mengandung knomosom kedua induk disebut sebagai sel hybrid. Frekuensi fusi dipengaruhi bermacam­macam faktor:

• ­ Jenis medium.
• ­ Perbandingan jumlah sel timpa dengan sel mieloma.
• ­ Jenis sel mieloma yang digunakan.
• ­ Bahan yang mendorong timbulnya fusi (fusogen), misainya  polyethylene glycol

Secara garis besar fusogen dibagi menjadi 2 kategori: ­ Virus berselubung. Yang sering digunakan adalah virus Sendai.­ Reagensia tipofitik atau tipolitik, misal lysole cithin dan

polyethylene g1ycol